연세대학껓 생화학씄험(2) - PCR mediated mutagenesis

◆ 목적 : PCR을 이용하여 deletion mutation을 만들어보고, PCR을 이용하는 다양한 mutagenesis 들의 방법과 원리에 대해 이해한다.
◆ 원리
<PCR>
중합 효소 연쇄 반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)은 이미 알고 있는 염기 서열 중 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 수 있는 분자생물학적인 기술로, 대장균이나 효모 같은 생물을 쓰지 않는 방법이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액도 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, 매우 널리 사용되고 있다.( Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭, 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning, DNA sequencing, 돌연변이 검사, 병인성 바이러스 및 박테리아 검출, 유전자의 footprinting, 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis) 등)

<PCR mediated mutagenesis>
PCR mediated mutagenesis에는 insertion과 deletion 두 가지가 있다. insertion방법은 삽입할 DNA의 끝부분 sequence왿� 삽입 어질 부분의 sequence를 합친 primer왿� 만들어질 DNA의 양 끝 부분의 primer를 각각 합성하여 각각 삽입될 부분의 왼쪽과 오른쪽 부분, 그리고 삽입할 DNA를 PCR로 증폭한 후, 양 끝 primer를 이용하여 PCR하면 세가지 template의 겹치는 부분들을 타고 한 개의 insertion이 이루어진 DNA가 만들어진다. Deletion은 제거되길 원하는 부분의 양쪽의 바깥쪽 sequence를 이은 primer왿�, DNA 양 끝 부분의 primer를 이용하여 제거될 부분을 제외한 왼쪽과 오른쪽 DNA 부분을 각각 PCR로 증폭하고, 이 두 template를 DNA 양 끝부분 primer로 한꺼번에 다시 ligation하면 deletion된 DNA가 만들어진다.