생화학 실험 2 전반부 : 6주차레포트 : PCR-Mediated Mutagenesis

(1) PCR(Polymerase chain reaction)이란?
* PCR은 DNA polymerase 반응을 연속적으로 수행하여 DNA를 증폭하는 방법이다.

* PCR은 기복적으로 세 단계(denaturation, annealing, extension)로 구성되며, 이를 25~30번 반복 수행하면서 최고 약 1백만배까지 template DNA의 증폭을 얻게 된다.
① step 1: DNA denaturation step: double strand DNA를 열에 의해(92~95) single strand로 분리
② step 2: annealing step: DNA primer가 DNA에 결합하는 단계(45~55)
③ step 3: extension: DNA polymerase에 의해 DNA 합성이 일어나는 단계(72일반적)

* 생명과학 뿐 아니라 임상의학연구, 특히, 법의학에 획기적인 영향을 주었으며, 그 공로로 개발자인 Dr. Mullis가 노벨상을 수상

* 개발초기(1980년경)에는 매우 제한적으로 사용 but 1980년 중반 다음과 같은 세 가지 기술들이 개발되어 PCR이 비로소 실용화되어 널리 사용되기 시작
① heat-stable Taq polymerase의 개발
② oligonucleotide synthesis의 자동화
③ Pellitier chip(heat block의 급한 온도변화를 가능하게 함)

* PCR reaction에 필요한 reagents
① DNA polymerase(Taq polymerase): 호열세균인 Thermus aquatics에서 추출하였으며, 열에 안정한 단백질이다.
② DNA primer: 두 개의 primer가 필요, DNA template에 >18bp의 상보적 sequence로 갖게 설계한다. (primer의 설계가 PCR 반응의 핵심.)
③ dNTPs(deoxynucleotides): DNA 합성에 필요한 dNTP를 제공
④ template DNA: 증폭의 주형으로 극미세량(약 10pg)의 DNA도 충분
⑤ Tag polymerase buffer: Tris-HCl buffer, DTT, Mg