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전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.
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최초등록일 2009.10.28 최종젿작일 2008.01
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    소개

    전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.

    목차

    1. Introduction
    2. PROCEDURE & RESULTS
    < R E F E R E N C E >

    본내용

    1. Introduction


    전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.

    2. PROCEDURE & RESULTS

    <primer stock의 dilution>
    먼저 210bp를 PCR할 때 쓸 primer F왿 R을 100μM stock으로 만든 다음에 새 tube에 1/5로 dilution 한다. (DDW 80㎕에 primer stock 20㎕를 넣는다.)

    <Insert의 PCR>
    그 다음 PCR tube에 다음과 같이 넣고 PCR을 돌린다.

    annealing할 때 시간은 1Kb당 1분으로 계산하고 온도는 G≡C 4℃, A=T 2℃으로 계산하면 된다. 따라서 primer의 서열이 ACGTTAG라면 2 + 4 + 4 + 2 + 2 + 2 + 4 = 20℃가 annealing 의 온도가 된다.

    <agarose gel을 통한 size 확인>
    PCR이 끝난 뒤에 agarose gel에 100V에서 20분 전기영동 시킨다.
    agarose gel을 만드는 방법은 먼저 TBE buffer 2.5X를 0.5X로 dilution 한다. (TBE buffer 20ml + DDW 80ml)
    여기서 20ml를 버리고 80ml를 agarose 0.8g을 넣어서(1%) 전자레인지에 3분 정도 돌린다. 여기에 EtBr을 1λ만큼 넣어서 작은 agarose gel과 큰 agarose gel(2 well)에 각각 10ml 60ml 정도 나누어 부어 굳힌다. EtBr은 DNA 사이사이에 끼어들어가 DNA가 어느 위치에 있는지 알 수 있게 해준다.

    참고자료

    · < R E F E R E N C E >
    · 1) Gene cloning and DNA analysis An Introduction, T.A.Brown, Fourth Edition
    · 2) Size marker
    · http://images.google.co.kr/imgres?imgurl=http://www.bioneer.co.kr/upimage/product/pro57840p111-02.jpg&imgrefurl=http://www.bioneer.co.kr/product/product_desc.jsp%3FtopPClassCode%3D681%26pclassCode%3D696&h=413&w=180&sz=16&hl=ko&start=2&tbnid=Sdb1v6W41d_PLM:&tbnh=125&tbnw=54&prev=/images%3Fq%3Dsize%2Bmarker%2B100bp%26svnum%3D10%26hl%3Dko%26lr%3D%26newwindow%3D1%26sa%3DN
    · 3) pET 23c vector
    · http://www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB051.pdf
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