Competent cell preparation & Transformation

Material
실험복, 실험용 장갑, 튜브, 튜브꽂이, 피펫, DH5, ligation product, X-gal/IPTG, 액체질소, 삼각밀대, high speed centrifuge, shacking incubator, centrifuge
Method
*Competent cell preparation
[1] DH5 균주가 있는 LB plate에서 single colony를 5ml LB broth 에 넣어 37℃ shaking incubator에서 6-12시간 키운다. (seed culture)
[2] 키운 cell중 1ml를 100ml LB broth에 넣어 OD600 0.5가 될 때까지 37℃ shaking incubator에서 키운다. (sub-culture)
[3] tube에 각 조당 20ml씩 옮겨 담고 20분간 얼음위에 둔다.
[4] high speed centrifuge, 7min, 4℃
[5] 상층액을 따서 버리고 2ml의 ice-cold TSS를 넣어준 후 pipetting 해준다.
[6] 액체질소를 이용하여 얼린다.
*Transformation
[1] 미리 만들어둔 competent cell에 ligation product를 넣고 얼음위에 15분간 둔다.
[2] 42℃에서 45초간 heat shock를 준 후 얼음위에 3분간 둔다.
[3] LB broth 900μl넣고 37℃ shaking incubator에서 40분간 둔다.
[4] centrifuge, 1min, RT
[5] 상층액 870μl는 따서 버린다.
[6] 남은 것과 X-gal은 /IPTG를 Amp plate에 spreading 한후 37℃ incubator에서 over night 시킨다.
Resurt
competent cell이 성능이 좋지 않아 DNA가 제대로 보이지 않는다.정상적으로 추출했을 때왿� 비교하기 위해 밑에 사진을 첨부했다.
Discussion
①TSS
● 85% LB broth
Luria-Bertani media 에서 앞 글자만 따서 LB 배지라고 한다. broth는 (세균)배양액을 뜻한다. LB broth는 미생물을 키울 때 일반적으로 사용하는 박테리아 생장배지로 양분을 공급하는 역할을 한다.
● 10% PEG
두 종류의 세포를 그냥 섞어 놓으면 융합이 일어나지 않기 때문에 세포 융합 과정에는 특정 바이러스나 폴리에틸렌글리콜 같은 세포융합 촉진제를 사용한다.
PEG 란 polyethylene glycol의 약자로 수용성의 무독성 고분자 물질이다. 세포막을 부분적으로 파괴하여 바이러스가 유전물질(DNA or RNA)를 숙주세포에 주입하기 용이하게 하여 세포융합을 촉진하는 역할을 한다.