예비.Determination molecular weight of protein and separation by electrophoresis (SDS-PAGE)

1. 실험제목
Determination molecular weight of protein and separation by electrophoresis (SDS-PAGE)

2. 실험목적
electrophoresis에 의한 단백질의 이동 원리왿� 크기에 따른 분리 과정을 이해한다.

3. 실험원리
1) SDS-PAGE의 원리
보통 SDS-PAGE는 두가지의 다른 gel이 붙어있는 상태인 Disc(discontinuous pH 또는 disc) gel 전기영동으로 시행하게 된다. 이를 사용하면 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 되고, 그다음에 성질에 따라 분리되게 된다. 따라서 두 gel의 농도나 pH가 다르게 설정되어 있다.
윗부분의 gel은 stacking gel이라 부르며, acrylamide 농도는 주로 3~5%이고 pH는 running gel보다 2 정도 낮은 6.5를 주로 쓰게된다. 아래의 gel은 running gel, resolving gel, separating gel 등으로 불리며, acrylamide 농도는 분리하고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용한다.
Gel의 윗부분 완충용액(upper chamber buffer)의 glycine은 아미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 zwitter이온 형태로 존재한다. Gel에 형성된 well에 단백질 시료를 가하고 전기영동을 시작하면 Cl-이온과 단백질, glycine-이온이 모두 +극을 향해 출발하게 된다(Zwitter이온은 움직이지 않는다). 그런데 Glycine-은 stacking gel의 낮은 pH에서 다시 평형을 이루어 일부가 zwitter이온이 되어버리기 때문에 이 부분에서 움직이는 이온(mobile ion)이 없어지고, 결과적으로 전류가 감소하게 된다. 그러나 전체 gel 시스템의 전류는 유지되어야 하므로 이를 극복하기 위해 Cl-이온과 glycine-이온 사이에 매우 높은 전압차가 형성된다.