Plasmid Purification & DNA 전기영동(결과보고서)

1. 실험목적
① 플라스미드 DNA는 박테리아의 DNA에 비해 크기가 매우 작고, 상보적인 두 가닥의 DNA 사슬이 공유결합으로 연결된 원형을 유지한다. 이러한 구조적 특징을 이용하여 Plasmid DNA를 분리한 후 정제해 본다.
② DNA Purification 한 것을 이용하여 전기영동을 통해 DNA를 분리하여 확인한다. 전기영동의 원리에 대해 알고, agarose gel 전기영동 방법을 숙지한다.

2. 시약 및 기구
1)시약

① Buffer RP (resuspension buffer), GTE
->균을 풀어줌. solution Ⅱ가 모든 세균에 균일하게 처리될 수 있게 하기 위해 vortex 과정이 있기 때문에 세포막을 깨지 않고 세포의 형태를 유지하게 함
Glucose : 삼투농도를 맞추어 세포모양을 유지하게끔 한다.
Tris-Cl : 생화학적 반응에 대해 안정적이고 Ca(Ⅱ)에 의해 침전이 일어나지 않는다.
EDTA : 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion과 같은 이온들과 결합하여 기능을 상실하게 한다.->세포벽에 구멍을 낸다.
②Buffer LP (lysis buffer)
->세포막이 깨져 세포내용물이 용액으로 흘러나오면서 용액은 투명해짐. 염색체 DNA가 용액으로 흘러나오면서 점도가 매우 높아져서 끈끈해진다. 만약 투명하지 않은 부분이 있다면 균이 아직 덜 깨진 증거인데, 이를 방지하기 위해서 buffer RP을 넣었을 때 철저히 균을 풀어주어야만 한다.
SDS : detergent로 cell membrane을 용해시키고 단백질 등을 denaturation 시킨다.
NaOH : pH를 12~12.5로 만들어서 변성시킨다. plasmid DNA는 크기가 작고 supercoil이라 변성이 잘 안됨. 주 DNA는 크기가 크고 풀린 상태로 존재하기 때문에 더 많이 변성된다.
③Buffer NP(neutralize buffer)
->chromosomal DNA 및 potassium, SDS의 complex인 하얀 침전물이 생김
potassium acetate : DNA 의 전하를 상쇄해서 친수성을 없애고 DNA가 SDS왿� 엉켜서 침전하도록 만든다. acetate는 산성으로써 pH를 낮추는데 도움을 준다.
Glacial acetate acid : pH를 낮추어 중화시키는 목적으로 사용