Plasmid purification & DNA 전기영동

벡터의 점착성 말단이 외래 DNA가 삽입되지 않은 채 다시 붙는 경우가 있다. 따라서 외래 DNA가 삽입된 플라스미드왿� 삽입되지 않은 플라스미드를 구별해야 하는데, 이는 이론적으로는 매우 간단하다. DNA가 삽입될 벡터 플라스미드의 제한부위를 특정 유전자의 중간에 오도록 조작한다. 외래 DNA가 유전자 중간에 삽입되면 그 유전자는 기능을 잃어버리게 된다. 그러므로 외래 DNA가 삽입되지 않은 플라스미드는 유전자의 기능을 나타내나 외래 DNA가 들어간 플라스미드는 기능을 상실한다. 따라서 기능을 상실한 세균을 찾으면 된다.
실제로 DNA가 삽입된 플라스미드를 가지고 있는 세균을 찾는 방법 중 하나는 테트라사이클린(tetracyclline)과 같은 항생제 저항성 유전자를 클로닝의 제한자리에 놓는 것이다. 이 경우, 앰피실린 저항성 유전자는 그대로 있으며, 삽입된 DNA에 의해 테트라사이클린 저항성 유전자는 불활성화되었기 때문이다. 다른 방법은 유전자의 산물이 푸른색을 띠나 그 유전자에 DNA가 삽입되면 무색으로 변하는 유전자에 벡터 플라스미드의 클로닝 제한부위에 놓는 것이다. 이 경우에는 푸른색을 띠는 세균 군체는 외부 DNA가 삽입되지 않은 플라스미드만 가지고 있는 것이고, 흰색을 띠는 군체는 배지에서 RJ내 시험관 등에 키우면 플라스미드 DNA는 증식되어 수백만개의 사본이 된다.
- 염색체 DNA왿�는 독립적으로 존재 하는 환형의 DNA
- 독립적으로 복제 할 수 있도록 하는 자기 복제 기점(Ori)을 갖고 있다.
- 주로 mini prep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법.
- 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method를 사용한다.
- 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것
- 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA왿� plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것
- 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않지만, 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리가능!!