단백질의 분리 및 정제

1. 단백질의 생산 및 분리
1) Production of proteins
무세포 번역 시스템 (cell free translation)
클로닝 된 유전자가 있을 경우, 유전자를 발현 벡터에 주입하여 바이러스 RNA polymerase왿� 함께 mRNA 합성 후
▷ 단백질을 생산하는 생체 외 전사 및 번역 방법
· 생체 외 전사 및 번역 방법
: 독성으로 인한 세포 내 발현이 어려울 경우,
단백질이 inclusion body로 생산될 경우,
protease에 의해 빠르게 분해 될 경우
virus promoter가 있는 발현 plasmid 선형화
→ virus RNA polymerase, rNTP 첨가를 통한 RNA 합성
→ 방사성 표�� 단백질 합성
→ SDS-PAGE 후 방사선자기사진법으로 확인
단점 : 수득 미량
장점 : 빠른 유전자 산물 획득
활용 : 돌연변이 확인, protein folding, protein modification
2) Salting-out
단백질의 용해도 변화를 통해 수용액으로부터 단백질을 침전시켜 분리하는 방법
· 염석 (salting-out) : 단백질이 높은 염도에서 용해도가 감소하여 침전을 일으키는 현상
· 단백질의 용해도 감소 원인 : 단백질과 결합하는 수화막이 염도가 높아짐에 따라 염과 결합하기 위하여 단백질에서 해리되기 때문
· 장점 : 단백질의 volume 감소
∴ 많은 양의 묽은 단백질 용액을 농축하는 첫 단계에 사용
· 황산암모늄 (ammonium sulfate) : 염석에 가장 많이 쓰이는 화합물
- 장점 : 용해도가 매우 높아 4M 이상의 수용액 제조 가능
단백질을 비가역적으로 불활성화시키는 부작용이 없음
c.f 염해(salting-in)
단백질에 존재하는 이온들의 해리효과에 의해 낮은 염도에서 단백질의 용해도가 증가하는 현상

<중 략>

2. 단백질의 확인
1) SDS-PAGE
단백질을 크기별로 분석할 수 있는 간단하면서도 민감한 단백질에 대한 필수 분석법