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[생명과학실험]Western blot analysis

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최초등록일 2016.05.05 최종젿작일 2016.05
Western blot analysi 생명과학실험 Western blot
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[생명과학실험]Western blot analysis
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    목차

    1. 실험 목적
    2. 실험 이론 및 원리
    3. 실험 기구 및 시약
    4. 실험 방법
    5. 실험 결과
    6. 토의 사항
    7. 참고 문헌

    본내용

    정제를 할 때에는 이온 교환 형식만 가지고는 완벽하게 정제하기가 불가능 하다. 그래서 SDS-PAGE로 여러 protein이 섞인 것을 확인할 수 있다. 이제 그 안에 존재하는 protein 중에 어느 protein이 진짜 원하는 AP를 포함하고 있는지 확인해 보는데 이때 사용할 것이 Western blot이다. Western blot으로 우리는 sample안의 무수히 많은 protein 중에 어떤 것이 진짜 원하는 AP인지 어느 sample에서 그 농도가 가장 높은지를 확인해 보고자 한다. 일단 가장 먼저 gel에 protein을 loading해서 내린다. 그 후 nitrocellulose membrane에 charge를 이용하여 protein을 붙인다. 그 이유는 gel은 gel 자체의 두께도 두꺼운 편이고 gel안에 protein이 들어있는 것이기 때문에 protein에 따로 항체를 붙이는 등의 처리를 하기 위해서는 따로 purification을 해야 한다.

    <중 략>

    1.1.1. SDS-PAGE gel에 protein marker(PM) 5µl왿 각 sample 10µl를 loading한다.
    1.1.2. 80V에서 30분 loading을 하고, running gel에 도착하면 160V로 1시간 loading한다.
    1.1.3. fiber pad왿 3㎜ paper는 먼저 Transfer buffer에 적셔둔다.
    1.1.4. Plate에서 gel을 꺼내어 protein이 없는 stacking gel부분을 잘라내고 Transfer buffer에 담근다.

    <중 략>

    PM을 보면 붉은 색으로 나타난 부분이 70kDa이고, 바로 그 위가 100kDa정도의 분자량을 나타냄을 알 수 있다. 이때 실험자의 결과를 보면 30-1을 제외 한 모든 용액에서 약 85kDa의 분자량의 protein이 검출되었음을 알 수 있다. 이때 AP는 약 83kda의 분자량을 가지므로 유사한 분자량을 가진 protein이 검출 되었음을 알 수 있다. 특히 200-1과 200-2의 band가 매우 선명하고 노이즈가 적다. 그러므로 200-1과 200-1에는 다른 종류의 protein이나 오염물질이 다른 샘플에 비하여 매우 적고 원하는 크기의 protein이 많이 녹아 있을 것이라고 생각 할 수 있다.

    참고자료

    · Tween® and Tween 20® are registered trademarks of ICI Americas
    · Ayorinde FO, Gelain SV, Johnson JH Jr, Wan LW. (2000). "Analysis of some co㎜ercial polysorbate formulations using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry". Rapid Co㎜unications in Mass Spectrometry14 (22): 2116–2124
    · Joint FAO/WHO Expert Co㎜ittee on Food Additives (1974). "Toxicological evaluation of some food additives including anticaking agents, antimicrobials, antioxidants, emulsifiers and thickening agents". WHO Food Additives Series No. 5. World Health Organization
    · Chunhee Kim, You-Lo Hsieh (2001). "Wetting and absorbency of nonionic surfactant solutions on cotton fabrics". Colloids and Surfaces A187: 385–397. doi:10.1016/S0927-7757(01)00653-7
    · Hempelmann E (2008). "SDS-Protein PAGE and protein detection by silverstaining and i㎜unoblotting of Plasmodium falciparum proteins". Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (eds) Methods in Malaria Research, 5th edition: 263–266
    · Davis BJ, Ornstein L (1959). "A new high resolution electrophoresis method.". Delivered at the Society for the Study of Blood at the New York Academy of Medicine.

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