DNA gel electrophoresis Plasmid DNA isolation

1) Bacterial culture tube에 LB broth 5ml 과 antibiotic이 포함되어 있는 곳에 재조합된 bacteria의 single colony를 picking하여, 접종한다.
2) Shaking incubator에 37℃, 250rpm조건으로 16~18hr 동안 배양한다.
3) 배양이 끝난 후 원심분리기로 5분 동안 4℃, 4,500rpm에서 원심 분리하여 cell down한다.
4) 원심이 끝난 후 상층액을 버린 다음 침전된 pellet을 Cold-STE buffer (0.25X volume)로 가볍게 washing해준다. 이유: bacteria에 묻어있는 배지 성분을 깨끗하게 닦아주는 역할을 한다.
5) 다시 5분간 4℃에서 4,500rpm으로 원심분리 후 상층액을 버린다.
6) 아래 사진에서 보듯이 RNase를 첨가한 alkaline lysis solution I 200㎕를 Bacterial culture tube에 있는 cell pellet에 첨가한다.
7) alkaline lysis solution II 300㎕을 첨가한 후 4~5회 천천히 inverting한다. 절대 세게 흔들거나 voltexing해서는 안 된다.
8) Tube를 조심스럽게 연후 alkaline lysis solution III 250㎕을 첨가한 후 4~5회 천천히 inverting 한다.
9)원심분리기로 10분 동안 4℃ 에서 12,000rpm으로 원심 후 상층액만을 새 tube에 조심스럽게 옮긴다.
10) 상층액과 1:1 volume의 PCI solution(phenol / chloroform / Isoamyalcohol = 25:24:1 v/v/v )을 첨가한 후 voltexing하고 5분간 상온에서 12,000rpm으로 원심을 한다.
11) 상층액만을 조심스럽게 새로운 tube에 옮긴 후 -20℃ 에 보관된 100% ethanol 을 상층액의 2배 volume으로 첨가한 후 가볍게 흔들어 준 다음 -20℃ 에 30분 또는 1hr동안 방치한다.
12) -20℃ 에서 20분 동안 12,000rpm에서 원심을 하면 밑에 조그마한 하얀 pellet생성된다.