DNA 추출 실험 레포트

1.실험 제목 :
Kanamycin(항생물질의 하나)이 포함된 LB 배지를 이용하여 배양한 DH5α 내 pET30b plasmid 정제

2.실험 목적 :
미리 배양된 pET30b plasmid를 가진 DH5α를 boiling method를 이용하여 pET30b를 정제하는 과정을 습득한다.

3.실험 기구 및 재료 :
Micropipette, Tips, 15ml tubes, 1.5ml tube, 3M sodium acetate, 70% ethanol, prepared DH5α and STET solution, lysozyme, Isopropanol, sterile water

4.실험 원리 :
세포로부터 DNA를 파괴시키지 않고 비교적 자연적인 상태로 분리하기 위해서는 먼저 DNA가 세포 밖으로 유출 될 수 있도록 세포벽 및 세포막을 잘 분해시켜야 한다. 다음으로 세포막을 파괴할 때 유리되는 DNA가수분해 효소들의 활성을 최대한 억제시킨 조건하에서 DNA를 분리하여야 하며, 마지막으로 여러 가지 용매에 의한 분별 분리 법으로 단백질이나 RNA의 혼입을 최소한으로 줄이면서 DNA를 분리하여야 한다. 세포벽을 가지는 생물체의 경우 우선 라이소자임(lysozyme)효소 처리로 세포벽을 파열시키고 세정제 처리로 완전히 분해된다. EDTA가 효소활성을 저해시키고 세포 밖으로 유출 된 DNA분핵은 단백질침전, 에탄올 침전, isopropenol 침전 과정으로 정제 된 후 에탄올이 DNA만을 선택적으로 침전시킨다.

5.실험 방법 :
1.Boiling miniprep bufferⅠ만들기
• 40% sucrose 10ml → 2ml : 세포가 깨지지 않도록 삼투압 조절
• Triton-X100 250μl → 50μl : 계면활성제의 일종, 세포막(인지질)을 파괴하기 위해
• 0.5M EDTA 5ml → 1ml : DNase의 활성 억제, 세포벽의 금속이온을 약화