T-vector왿� insert DNA 비율을 달리하여 TA cloning을 통해 얻어진 colony 비교 분석

1. Subject : recombinant plasmid DNA cloning

2. Object: T-vector왿� insert DNA 비율을 달리하여 TA cloning을 통해 얻어진 colony를 비교 분석해본다.

3. Introduction
TA cloning : 보통 PCR product는 3’ 말단이 blunt end로 되어 있는 줄 알지만 그렇지 않은 경우가 많다. 특히 PCR에 사용하는 polymerase는 Thermus aquaticus (Taq) polymerase를 많이 사용하는데, Taq polymerase는 Terminal deoxynucleotidyl transferase로서 Extension이 끝날때 3’말단에 nucleotide A를 더 붙이고 끝이 나는 특성을 가지고 있다. 단 단지 한 개의 A만을 붙이고 끝이 나기 때문에 DNA를 cloning을 하고 싶다면 vector의 5’ 말단이 T로 끝나는 vector를 사용하면 되고 그렇기에 이 cloning이 TA cloning이라고 불리는 것이다.
T-vector를 만드는 방법은 어떠한 vector에 상관없이 blunt end를 만드는 제한효소를 처리한 후 전기영동을 한 후 gel purifiction을 하고 이 product 5ul에 dTTP 2mM(final), 10X Taq buffer, Taq polymerase(5unit)를 넣고 70℃ 2시간 PCR한다음 PCR product를 정제한 후 사용한다고 한다.
이러한 T-vector를 이용하는 이유는 여러가지가 있을 수 있는데 우선 PCR product양이 너무 적을 경우 cloning을 위한 PCR반응 산물이 너무 적을 경우 제한효소 처리 및 DNA추출 과정에 따른 insert DNA 농도가 줄게 됨에 따라 vector에 삽입 할때 부담이 크다. 그렇다고 PCR reaction cycle수를 늘리면 중간에 mutation이 발생할 우려가 있다.