[A+ 리포트] Western blot 2 (Antibody & Detection(ECL))

3. Purpose :
가. 항원-항체 반응을 이해하고, 이를 통해 특정 단백질을 찾을 수 있음.

나. 항원-항체 반응 이후, membrane을 ECL에 반응시켜 band를 확인할 수 있음.

4. Materials : TTBS, S1 pipette filler, ATG5 primary antibody(Recombinant Anti-APG5L/ATG5 antibody [EPR1755(2)]), 5% skim milk, 마이크로 피펫, 피펫팁, 15ml tube, mouse-anti-rabbit IgG-HRP(secondary antibody), ECL, 킴테크 왿�이퍼, 1.5ml tube, 70% 에탄올, 집게, 폐기통

5. Method :
가. Antibody (항원-항체 반응)
1) Blocking이 끝나면 Western blot box에 담겨 있는 5% skim milk를 버림.
2) TTBS로 간단하게 washing함.
3) washing 후 ATG5 primary antibody를 준비함.
4) ATG5 primary antibody는 5% skim milk로 희석함.
(skim milk : antibody = 1,000 : 1)
가) 5% skim milk 10ml를 western blot box에 넣음.
나) primary antibody 10㎕를 western blot box에 넣음.

5) primary antibody는 4℃에서 overnight으로 반응시킴.
6) ATG5 antibody가 포함된 5% skim milk는 재사용을 위해 15ml tube에 옮긴 후 냉장보관함.
7) overnight 후에 TTBS로 washing함.
가) TTBS 10ml를 western blot box에 넣음.
나) 10분간 washing함.
다) 10분 후 washing이 끝나면, TTBS를 버림.
라) 과정 가)~다)를 2회 더 반복하여 시행함.