Gel extraction / TA-cloning / Transformation / Blue-white selection

Gel-elution

Introduction(실험소개)
전기영동이 끝난 후 밴드를 이용해 젤에서 DNA를 추출해내는 실험이다.

material method
실험재료에는 에펜도르프 튜브, 칼, 전기영동이 끝난 젤, 스핀칼럼, 100% isopropanol, FB버퍼, 워싱 버퍼, BST 버퍼, 뉴클리에이즈 프리 워터가 필요하다,
먼저 젤을 담을 에펜도르프 튜브를 준비한다. 알코올 램프를 켜 칼을 멸균시킨 뒤, 전기영동이 끝난 젤에서 밴드를 칼로 절제해준 다음 에펜도르프 튜브에 담아준다. 젤 슬라이스에 먼저 FB버퍼를 800μl 넣어준다. 일반적으로 젤을 일루션 함에 있어서 젤 400mg당 3V의 FB버퍼를 넣게 되어있다. 본 실험에서는 젤의 크기에 따라 800μl를 넣어주었다. 그 후 50도씨에서 10분 정도 인큐베이션 시켜 젤을 녹여준다. 젤을 녹일때에는 중간중간 inverting을 해줘서 젤이 완벽하게 녹게끔 해 준다.
젤이 완전히 녹은 다음에는 100% isopropanol을 동일 볼륨, 즉 800μl 섞어주고 샘플을 스핀칼럼에 넣어준다. 그런 후 멤브레인을 Activation 시켜주는 과정을 가진다. 여기에 100μl BST 버퍼를 집어 넣고 13000rpm에서 1분간 원심분리해준다. 원심분리시에는 밸런스를 집어 넣어준다. 이 과정으로 BST 버퍼를 아래쪽으로 다운시키면서 실리카 멤브레인을 activation시켜줄 수 있다. 원심분리가 끝난 후 스핀칼럼 아래로 떨어진 BST버퍼는 버리고, 동일 볼륨의 100% isopropanol,즉 800μl를 집어 넣어준다. 파이펫으로 업앤다운 하면서 샘플을 잘 섞어준다. 그런 후 13000rpm에서 30초 정도 스핀시켜줘서 위에있는 샘플을 아래로 다운시켜준다. 샘플이 아래로 내려온 걸 확인한 후, 샘플을 스핀칼럼에 넣고 마찬가지로 13000rpm에서 30초 정도 스핀시켜준다. 이러한 과정으로 실리카 멤브레인에 목적하는 dna가 부착하게 되고, 나머지 버퍼왿� 아가로즈들은 아래로 떨어지게 된다.