Exp. 6 western blot

Western blot은 찾고자 하는 protein의 antigen epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는 방법이다. 전기영동을 이용하여 단백질을 gel 상에서 크기에 따라 분리한 후, PVDF, nylon과 같은 membrane에 transfer한다. Membrane에 발광하는 probe가 붙어있는 antibody(항체)를 붙여주는 항원-항체 반응을 이용하여 찾고자 하는 특정 단백질을 검출한다. 본 실험에서는 DcHSP70의 발현 여부를 확인하기 위해 Hsp70 primary antibody를 이용하여 Western blot을 실시하였다. 먼저 3가지 sample BL21(DE3), BL21(DE3)containing pET11a-ADH, BL21(DE3)DcHsp70 containing pET11a-ADH을 이용하여 SDS-PAGE gel에 loading 하여 단백질을 분리하였다. 분리된 protein을 PVDF membrane으로 옮기는 transfer과정을 실시하였다. transfer sandwich 과정을 transfer을 진행하여 running gel에 있던 protein이 membrane으로 옮겨진다. membrane에 단백질에 옮겨졌으면 blocking 과정을 non-fat milk왿� PBS-T buffer으로 membrane 표면을 washing하고 HSP70 primary antibody를 희석하여 넣는다. 다시 PBS-T buffer로 washing을 진행하고 형광으로 발광하는 HRP를 결합하고 있는 secondary antibody를 실시한다. 이는 실험에서 target으로 하는 단백질을 시각적으로 확인할수 있도록 제공한다. 이렇게 나온 결과를 detection 과정을 통해 확인하였더니 DcHSP70을 가지고 있는 line 3에서 SDS-PAGE 결과 가장 큰 band가 나타났고..

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