ligation과 kit을 이용한 mini prep

이번 실험의 목적은 제한효소로 처리하여 얻어낸 insert DNA를 pET21a vector에 넣은 후 확인하는 것으로 ligation product을 C cell에 형질전환하고 colony을 선택한다. plasmid DNA를 mini prep(kit)을 통해 정제하고 추출한 뒤 Agarose gel상에서 전기영동하여 vector DNA insert DNA를 분리한다. ligation이란 DNA를 접합하는 것이다. 이번 실험에서 T4 DNA ligase을 사용하며 이는 T4 bacteriophage에서 유래된 것으로 ATP, Mg2+를 cofactor로 사용하여 5’-P왿� 3’-OH 간 phosphodiester bond를 형성해서 DNA를 접합한다. Vector의 self-ligation을 방지하는 방법으로는 double digestion, vector의 5’end에 대해 dephosphorylation해주는 방법이 있다. 이번 실험에서는 두개의 제한효소를 이용하여 double digestion했다. Mini prep의 전체적인 실험 순서는 Resuspension step, Lysis & denaturation step, Neutralization & renaturation step, EtOH, Isopropanol precipitation step순이다. 실험방법으로는 <Table.1>처럼 조성하여 형질전환 하고 열충격과 냉각을 가해주고 원심분리하여 ampicillin agar plate에 도말하여 colony을 확인한다. 이후 mini prep(kit)을 통해 plasmid DNA를 정제, 추출하여 제한효소 처리하고 전기영동을 통해 vector왿� insert DNA를 분리하여 확인한다. 실험결과, <Fig.2>의 아래 사진처럼 vector only왿� vector-insert ligation 모두 colony가 관찰되지 않았다. 원인으로는 vector왿� insert가 tube안에 잘 들어가지 않았거나, 도말 시 너무 고온이라 세포가 죽은 것이라 생각된다.