[분자세포생물학씄험 A+ 예비 및 결과 보고서] Gene cloning 2. Ligation and Transformation

Purpose
Ligase라는 효소를 이용하여 이전에 실험에서 제한 효소로 절단한 vector왿� insert를 연결하여 재조합 DNA 분자(recombinant DNA molecule)를 제작하고 만들어진 재조합 DNA를 DH5α라는 대장균에 형질 전환 시킨다. Ligase에 의한 ligation의 원리왿� 형질전환 (transformaion)의 기본 원리왿� 실험에 사용할 competent cell에 대해 알아보고자 한다.

Introduction
3.1 Ligation과 DNA ligase
Restriction으로 원하는 부분만 잘랐던 vector왿� DNA 절편(insert)를 plasmid 형태로 붙여주는 과정으로 제한 효소로 절단 된 vector왿� insert는 상보적인 DNA sequence을 가지고 있기 때문에 염기 간 수소 결합으로 붙을 수 있다. 하지만 이 결합만으로 불안정하기 때문에 두 개의 큰 DNA 분자가 phosphodiester band로 단단히 결합할 수 있도록 ligase를 사용한다.
DNA ligase란 원래 세포 내에서 DNA가 복제되는 동안 발생하는 DNA 파손 혹은 결손 시 이를 복구하는 효소이며, DNA polymerase왿�는 작용기작이 다르다. 이 경우 5‘말단에서 3’말단으로 방향성을 가지며 DNA를 합성하는 반면, ligase는 방향에 관계 없이 비특이적으로 반응하여 DNA를 복구시키거나 결합 시킨다. ligase의 기능은 크게 2가지가 있다. (1) dsDNA의 한가닥 phosphodiester bond가 nick(결손)되었을 경우 이를 연결해 준다. (2) 2개의 DNA 2중 가닥이 있을 경우 이 두분자를 연결하는 역할을 한다.
Ligation의 기본 원리는 EcoRⅠ으로 잘린 sticky ends가 서로 만나 상보적으로 결합하게 되는데, 이때 DNA backbone(vector plasmid)왿� insert DNA의 5‘-phosph group과 3’-hydroxy group을 결합