GFP 단백질과 단백질 정량(Protein Measurements)

Ⅰ. 요약(Abstract)
이번 실험은 Lowry assay왿� Extinction coefficient assay 두 가지 방법을 이용하여 EGFP의 농도를 측정하는 실험이었다. Lowry assay는 Biuret reaction에 Folin reaction을 추가하여 Extinction coefficient assay 보다 단백질 검출 감도를 향상시킨 단백질 정량법이다. 몰리브덴과 텅스텐의 인산염을 포함하고 있는 Folin reagent 가 환원됨에 따라 나타나는 750nm의 흡광도를 측정하는 방법이다. 이 때 환원되는 Folin reagents의 양이 많을수록 진한 푸른색을 띠게 된다. Lowry assay는 biuret에 비해 sensitivity가 더 높기 때문에 감도가 더 좋다. 두 번째 방법은 Extinction coefficient assay이다. Extinction coefficient assay는 분광광도법과 시료의 몰흡광계수를 이용하여 용액의 단백질 구조를 직접 결정하는 방법이다. 특정 아미노산 흡광도를 이용하여 단백질 농도를 측정하는 방법과 특정 단백질의 3차구조를 이용하여 단백질 농도를 측정하는 방법이 있다.
먼저 Extinction coefficient assay의 실험과정은 다음과 같다. 먼저 cuvette에 PBS 1ml를 넣고 spectrophotometer의 blank를 설정한다. 그 다음 다른 cuvette에 PBS 960ul왿� EGFP 40ul를 넣고 pipetting으로 잘 섞어준다. 그 후 spectrophotometer를 이용하여 488nm에서의 흡광도를 측정하고 계산하면 된다. 두 번째로 진행한 실험인 Lowry assay는 6개의 well plate에 BSA의 농도가 0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08이 되도록 PBS왿� BSA를 넣어준다. 그 후 solution A왿� B를 각각 250ul과 2ml씩 넣어주고 750nm에서 흡광도를 측정한다. 그 다음 BSA standard curve를 이용해 EGFP의 질량농도를 계산한다.
두 가지 실험방식을 이용해서 측정한 양은 각각 0.20196mg/ml 왿� 0.16000831061mg/ml 만큼 나왔다. 따라서 오차가 발생했는데 이는 흡광도의 차이에서 온 것이라고 생각해 오차의 원인을 호일, 장갑이나 용기 등에서 찾을 수 있었다.