Restriction enzyme reaction과 Ligation (A+ 평가자료)

본 실험에서는 my product(clean up PCR product)왿� pET28b를 이용하여 Enzyme cut, DNA clean up, Ligation 과정을 거쳐 Recombinant Plasmid (Ligation product)를 만들었다. 이어서 Ligation product를 TOP10 cell에 Transformation하여 Kanamycin처리한 배지에 배양하여 single colony를 관찰할 수 있었다.
먼저, 실험 과정에서 사용된 Materials에 주목하여 실험 원리를 이해해 볼 수 있었다. 첫 번째로, pET28b Vector에 관하여 탐구해볼 수 있었다. 본 실험에서의 enzyme site가 NdeⅠ, XhoⅠ인 점을 고려하여, pET28b Vector를 이용하여 만든 recombinant plasmid 중 NdeⅠ, XhoⅠ를 enzyme site로 갖는 pET28b- hTIG3(1-132)를 예로 들어 비교해 보았다. pET28b- hTIG3(1-132)의 형태왿� 특징을 아래의 표로 정리해볼 수 있었고, 이를 통해 pET28b의 특징도 이해할 수 있었다.
<표 1>에서의 pET28b-hTIG3(1-132)처럼 enzyme site는 NdeⅠ, XhoⅠ으로 동일한 것을 확인할 수 있었다. 이에 restriction enzyme NdeⅠ, XhoⅠ에 의해 절단된 말단부위의 특징과 restriction enzyme을 사용할 때의 반응조건에 관하여 탐구해보고, 본 실험 과정에 적용해 볼 수 있었다.위의 restriction enzyme의 인식부위를 고려하였을 때, Enzyme cut과정에서 사용한 Restriction enzyme NdeⅠ과 XhoⅠ는 sticky end를 형성한다고 판단할 수 있었다. sticky end는 제한 효소에 의하여 2~4개의 nucleotide를 엇물리게 절단하여 말단 부위에 형성되는 짧은 돌출 부위를 의미하고, Blunt end는 염기의 배열의 중간지점에 엇물리지 않게 이중가닥을 절단하여 생긴 말단 부위를 의미한다 . 이처럼 Enzyme cut에 사용되는 restriction enzyme은 특정 부위의 염기서열을 절단하면서 sticky end왿� blunt end를 형성한다.