서강대 현대생물학씄험 1 Taq DNA polymerase의 발현 및 정제, 확인

1. Abstract

이번 실험은 Thermus aquaticus(Taq) DNA polymerase를 Escherichia coli를 이용해 발현시키고 이를 정제해 PCR과 전기영동을 활용하여 확인하는 것이 실험 목표이다. 숙주세포로 사용되는 E.coli에 발현하고자 하는 단백질의 DNA가 vector에 들어있는 것을 사용했다. 균을 일정 흡광도 값에 도달할 때까지 배양하고 IPTG를 첨가하여서 lac operon을 activation시켰다. 이로 인해 단백질이 과발현되고 그 후에 단백질을 정제하는 과정을 진행했다. 먼저 Enzymatic method왿� Detergent method를 사용해 세포를 파괴하고 salting out으로 단백질을 침전시켰다. salt를 제거하기 위해 dialysis를 진행했다. 그 후 얻은 단백질이 Taq DNA polymerase인지 확인하기 위해서 시중 판매하는 Taq DNA polymerase왿� DIW를 대조군으로 설정하고 PCR에 넣었다. template DNA 증폭 후에는 전기영동을 통해서 DNA의 band를 확인했다. 실험 결과 얻어낸 단백질을 섞은 sample과 NC는 band가 발견되지 않았고 PC는 Taq DNA polymerase 크기의 이론값인 752bp 부근에서 band가 관찰됐다. 이런 오차가 발생한 원인은 실험 중 시료의 손실이 너무 많았기 때문이다. 시료가 손실되면서 그 안에 있던 단백질도 손실되어 PCR을 실시하였음에도 band를 관찰할 수 없었다.

2. Intro

본 실험에서 사용하는 Thermus aquaticus(Taq) DNA polymerase는 높은 온도에서 효소가 활성을 가지는 특성이 있기 때문에 PCR에 많이 사용된다. 이번 실험에서는 E.coli를 사용해 목적 단백질을 과발현 시키고 이를 정제해 확인하는 실험을 진행한다.
단백질은 특정 pH에서 가장 안정적인 상태로 존재하고 이때 활성이 가장 높다. 실험을 진행 할 때는 in vitro 상태에서 진행하기 때문에, 생체 내왿� 비슷한 환경을 만들어 주려면 pH를 안정적으로 유지시켜야 한다. 따라서 Buffer가 필요하다. Buffer란 소량의 나 가 추가되었을 때, pH 변화가 적고 이 변화에 저항하는 경향이 있는 용액을 의미한다. buffer는 약산과 짝염기로 구성되어있거나 약염기왿� 짝산의 혼합으로 이루어진다.