제한효소왿� 아가로즈젤 전기영동/ Restriction Digest and Agarose Gel Electrophoresis

1) Plasmid DNA

Plasmid DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 운반체 DNA로 사용되는데, 이 운반체 DNA를 Vector라고 한다. 주로 대장균에 vector를 삽입하는데 이 과정을 Bacterial Transformation이라고 한다. vector를 cell에 도입한 뒤, 선별을 위해 ampicillin이 함유된 배지에서 키우는 과정을 진행한다. ampicillin이 함유된 배지에서 자라난 colony는 Bacterial Transformation이 성공한 cell이다. 대장균 cell에는 plasmid DNA왿� 대장균 cell의 염색체 DNA인 chromosomal DNA가 독자적으로 존재하기 때문에 plasmid DNA를 따로 분리하여야 한다. cell에서 plasmid DNA를 따로 분리하는 과정을 Purification of plasmid DNA라고 한다. plasmid DNA 분리에는 boiling method, alkaline lysis, lithium based procedure 등 여러 방법이 있지만 가장 보편적으로 사용되는 방법은 alkaline lysis이다. 높은 pH의 알칼리성 용액을 사용하여 cell의 세포벽과 세포막을 용해시킨 후, 산성 용액을 처리하여 plasmid DNA만을 분리해내는 방법이다. 알칼리성 용액이 cell을 용해시키면 cell 안의 chromosomal DNA왿� 수확해야 할 plasmid DNA가 노출되어 변성이 일어나게 된다. 두 DNA 모두 변성이 일어나지만 산성 용액을 이용하여 용액을 중성으로 만들어주면 원래의 변성 전 상태로 복원이 된다. 하지만 chromosomal DNA는 크기가 크고 구조가 복잡하여 변성 전의 상태로 복원이 되지 못하고 침전이 되어 제거되며, plasmid DNA는 비교적 간단한 구조이기 때문에 원래 상태로 복원되게 된다. 분리가 끝난 plasmid DNA는 Electrophoresis를 통해 확인할 수 있다. 이렇게 분리한 plasmid DNA는 Electrophoresis로는 원하는 DNA 서열이 잘 나왔는지 알 수 없다. 일반적으로 Restriction enzymes를 처리하지 않은 plasmid DNA의 경우 open circular DNA, supercoiled plasmid DNA가 많이 관찰되며 Restriction enzymes를 처리하면 linear plasmid DNA가 관찰된다. open circular DNA는 DNA의 이중나선 구조 중에 한 가닥이 끊어져 super coil이 끊어진 구조를 말하며 Nick이라고도 한다. 이 구조를 가진 plasmid DNA를 Electrophoresis하면 3가지 구조 중 가장 얇은 형태의 band가 관찰된다. linear plasmid DNA는 Restriction enzymes를 처리했을 때 나타나며 circular 구조에서 두 가닥 모두가 끊어져 선형이 된 구조를 말한다. 이 구조는 supercoiled plasmid DNA보다는 얇은 band를 형성하게 된다. supercoiled plasmid DNA는 이중나선 구조의 DNA가 더 뒤틀리면서 초나선 구조를 형성한 것을 말한다. 이 DNA는 Electrophoresis 시 가장 두꺼운 밴드를 형성하며 뒤틀림 구조에 따라 모양도 제각각인 것을 알 수 있다. 따라서 restriction enzymes을 처리해서 원하는 DNA 서열만을 잘라내야 얼마나 수확했는지를 알 수 있게 된다.