이화여대 생명과학실험 A+ 리포트(Western Blot)

0. 실험목표
항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 Western Blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS - PAGE 분리, SDS - PAGE gel 로부터 membrane 으로의 단백질 transfer, 항원 - 항체반응 및 항체에 부탁된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험 원리 및 실험 기법을 습득한다.
이번 실험에서는 cell을 깨서 lysis를 해서 먼저 얻어낸 단백질 sample을아크릴 아마이드겔에다가 전기영동을 하면 전류에 따라서 분리된다. 그 젤에서 분리된 단백질을 멤브레인으로 옮기는 트랜스퍼 과정을 거친다. 그 다음에 그 멤브레인을 블라킹 하는 블라킹 솔루션을 부어서 블라킹을 해주고 그다음에 1차 안티바디왿� 2차 안티바디를 붙이고 디텍션을 한다. 이 과정에서 트랜스퍼가 성공적으로 이루어졌는지 폰슈 S 염색결과를 보며 분석하고 2차 항체왿� 1차 항체의 종의 동일 여부로 인한 디텍션 결과 및 단백질 양에 따른 밴드 분석을 통해 웨스턴 블랏의 전반을 이해하고 분석한다
1. Introduction
Western blot 은 항원 - 항체 반응을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 방법이다. 이러한 western blot 방법은 전기영동으로 분리한 단백질의 검출을 쉽게 하기 때문에 각종 분석에 이용되고 있다. Western blot 방법은 크게 3 단계로 나누어 진행되는데, 첫 번째로는 단백질 혼합물에 대하여 SDS - PAGE 를 수행하여 단백질들을 크기에 따라 분리하는 단계이다. 이 단계에서는 protein 이 고유한 3차 구조를 잃고 linear 상태가 되어 오직 분자량에 의해서만 단백질들이 분리된다. 두 번째 단계는 SDS - PAGE gel 상에 분리된 단백질들을 nitro - cellulose 등의 membrane에 transfer 하는 단계이다. 이 과정에서 단백질로부터 SDS 가 제거되어 단백질의 3차 구조가 재생되면서 본래의 항원 결정기를 갖게 된다. 세 번째로, 대상 단백질을 항원 - 항체 반응을 통해 검출해나는 단계이다.