Preparation and Concentration Determination of plasmid DNA from E.Coli-Midi-Scale Preparation

1. 실험제목
Preparation and Concentration Determination of plasmid DNA from E.Coli-Midi-Scale Preparation

4. 목적
cell 속에 있는 plasmid를 분리, 세척한다. 그 후, OD값의 측정을 통해 plasmid의 양과 순수도를 측정한다.

5. 원리
1) plasmid의 특징

(1) replication origin
이 부분은 plasmid가 자가 복제 할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분이다. 그림에서 보이는 ColE1 ori라고 쓰이는 부분이다.
f1(+) origin은 사실 plasmid의 origin of replication 이 아니라 bacteriophage의 origin이다. 이 염기 서열을 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 한다, bacteriophage의 장점은 life cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있다. 어느 쪽 strand가 single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-)origin을 이용한다.
plasmid를 사용하는 주목적이 재조합된 plasmid를 복제하여, 우리가 원하는 유전자를 다량으로 얻기 위함이다. 복제를 하기 위해서는 효소가 붙는 위치를 표시해 주는 복제의 시작점이 필요하다. 그런 의미에서 replication origin이 필요하다고 할 수 있다.

(2) selectable marker(antibiotics resistance gene)

이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자이다. 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서 나오는 단백질은 그 유명한 β-lactamase 이다. 때로는 kanamycin resistance gene을 쓰기도 하고, eukaryote expression vector에는 주로 neomycin resistance gene이 들어 있엇 이를 쓰기도 한다. 이 부분이 중요한 이유는 우리가 원하는 gene이 들어간 plasmid를 가진 박테리아를 찾아내려 할 때, 직접 보고 찾을 수 없으므로, 항생제를 사용한 배지에다가 이 박테리아를 키우게 된다. 만약 우리가 원하는 부분에 우리가 원하는 gene이 들어갔다면, 그 실험상황에 쓰인 항생제에 저항할 수 있을 것이고, 배지 중에 살아서 colony를 만든 박테리아들이 우리가 정확히 재조합된 plasmid를 갖고 있는 박테리아라는 것을 알게 된다. 예를 들어, plasmid에