효소의 활성측정

6. 실험방법
a. pH 변화에 따른 효소의 활성도 점검
① 감자를 강판에 갈아서 거즈로 걸러 카탈라아제 효소액을 마련한다.
② 준비된 효소액 1㎖를 각각의 pH 완충용액 1㎖왿� 섞는다. (총 2㎖)
③ 실온에서 1㎖의 20% HO solution with 0.25% SDS and 1% glycerol를 준비된 시험관에 넣고 timer로 거품이 시험관을 넘치기 직전까지 시간을 재고 기록한다.
b. 온도 변화에 따른 효소의 활성도 점검
① 준비된 카탈라아제 효소액 1 ㎖을 실험 1에서 가장 높은 활성도를 나타낸 pH 완충용액 1 ㎖과 섞는다.
② 조교는 각 조별로 반응시킬 온도를 정해 준다.
③ 1 ㎖의 20% HO solution with 0.25% SDS and 1% glycerol를 준비된 시험관에 넣고 지정된 온도에서 5분간 온도를 맞추기 위해 항온조에 넣은 후 기다린다. 이때 효소액 역시 지정된 온도에서 5 분간 기질용액과 섞기 전까지 온도를 맞춘다.
④ 기질용액과 효소액을 섞고 지정된 온도에서 반응시킨다. 두 용액을 섞은 직후부터 거품이 시험관에 넘치기 직전까지의 시간을 측정한다.
c. Enzyme kinetics analysis
① 준비된 효소액 10 ㎖을 최적의 pH의 완충용액 10 ㎖과 섞은 후 실험 2에서 알게 된 최적의 온도를 나타내는 incubator에 넣고 5 분간 기다린다.
② 조교는 각 조별로 실험할 기질을 지정한다 (5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % H2O2 solution with 0.25% SDS and 1% glycerol).
③ 각 조는 1 ㎖의 기질용액을 15 ㎖ 시험관에 넣은 후 효소액이 있는 incubator에 5 분간 넣고 기다린다.
④ 두 가지 용액을 섞자마자 timer로 거품이 시험관을 넘치기 직전까지 시간을 재고 기록한다.
* 실험 3의 경우 상온에서 할 수도 있다.
d. 각 조별로 나온 실험 결과를 그래프로 나타낸다. 또한 카탈라아제의 반응 속도를 계산한다. 최적의 조건에서 카탈라아제가 분해할 수 있는 HO는 몇 분자인지를 계산한다. Km이 얼마인지를 계산한다