Restriction Enzyme Digestion and Gel Electrophoresis( Plasmid DNA를 restriction enzyme으로 자른 후 DNA size marker왿� 비교하는 실험)

10. Further study
ⅰ) Plasmid DNA sequence 내의 enzyme site가 있음에도 불구하고 restriction enzyme으로 digest 되지 않는 경우가 있다. 이런 현상의 요인 중에 하나로 특정 enzyme site가 methylation 되기 때문인데 이런 methylation이 필요한 이유가 무엇인가?
☞ bacteria에서 발견된 restriction enzyme은 자기방어 기작으로써 외부에서 들어온 DNA sequence를 인지하여 그 sequence의 특정 site를 자르게 된다. 이는 bacteria가 가지고 있는 DNA sequence도 잘릴 수 있는 것을 의미하는데 이것에 대하여 bacteria는 자신의 restriction enzyme에 의해 인식되는 DNA sequence를 methylation시키므로써 restriction enzyme이 DNA 상의 sequence를 reading 할 때 restriction enzyme이 인식할 수 있는 DNA sequence를 그냥 지나가게 된다. 그러므로 restriction enzyme에 의해 DNA damage 피해를 없에기 위해 methylation은 필요하다.

ⅱ) Enzyme digest가 잘 되지 않는 요인이 여러 가지가 있는데 methylation 외에 실험과정 중 무슨 요인에 의해 restriction enzyme이 잘 작용하지 않을까?
☞ Plasmid DNA를 E.coli에서 분리할 때 마지막 과정에서 70% ethanol을 사용하였다. 이는 70% ethanol안에 들어있는 30%의 물이 salt를 제거해주기 때문인데 salt가 DNA에 남아 있으면 restriction enzyme이 작용할 때 충분한 activity를 나타내지 않거나 혹은 restriction enzyme이 DNA에 작용하지 않을 수도 있다. 그 이유로는 DNA sequence는 기본적으로 phosphate에 의해 negative charge를 띠고 있는데 salt를 제거하지 않은 상황에서는 많은 positive charge가 DNA sequence 주위에 몰려 있게 되고 이것은 restriction enzyme이 DNA를 scanning하여 restriction site를 찾는 것을 방해하게 된다.

ⅲ) DNA size가 클 경우 vortex를 하면 안 되는데 그 이유는 무엇일까요?