transposon mutagenesis

[Abstract]
이번 실험은 tansposon이 의미하는 바를 알고 가장 대표적인 예인 Tn3HOHO1을 이용하여 실험해본다. 1주일동안은 donor vector에서 pSHE에서 pHOHO로 transposase가 random하게 hopping하고 이것이 target vector에 들어가게 한다. 이 target vector를 recipient에 conjugation을 통해 전달하게 된다. 이렇게 전달된 것은 Ap100Tc10Nal20 x-gal배지에서 한번에 구별할 수 있다. transposon이 된것만 골라서 2주째에는 plasmid mini-preparation procedure, restriction enzyme(pst1, cla1) digestion, DAN 전기영동을 실시해서 어느 위치에 transposon이 전달되었는지 확인한다. 실험결과는 잘 나오지 않았지만, pst1을 이용하면 transposon이 insertion site에 잘 들어갔는지 알 수 있고, cla1을 이용하면 trasnposon 안에 pHOHO1이 제대로 들어간것인지 확실히 확인이 가능하다.

[Theory]
1 Vectors
유전자가 조절되는 방법을 조사하는 데에는 reporter gene을 가지는 벡터를 사용한다. 이것은 그 product가 쉬운 조사방법으로 정량적 측정이 가능한 잘 특성화되어있는 유전자이다. 관심 유전자 유래의 프로모터 영역이 reporter gene 앞에 클로닝되어 reporter gene의 product 양과 생산되는 조건이 조사된다. 다음 두 유형의 융합을 연구함으로서 관심유전자가 조절되는 방법 그리고 조절이 전사 or 번역 수준에서 이루어지는지에 대한 정보를 얻는다.
1)transcriptional fusion
관심유전자 유래의 전사에 필요한 신호들(-35, -10, +1영역)이 reporter gene앞에 위치한다. 번역에 필요한 신호들(RBS왿� met 유전암호)은 벡터에 미리 존재하고 있다.